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《刺客信条：叛变》的故事设定在18世纪中叶七年战争时期，将与系列作品《刺客信条3》《刺客信条4：黑旗》背景年代的故事衔接起来，构成完整的北美刺客传奇篇章。本作将为玩家带来期待已久的新元素，比如说扮演圣殿骑士一方。
《刺客信条：叛变》将为玩家在北美洲带来更多可探索区域，包含北大西洋极地水域、阿帕拉契山脉荒野河谷以及纽约，本作中玩家将以圣殿骑士的角度来体验《刺客信条》的世界观。主角谢伊．派崔克．寇马可（Shay Patrick Cormac）这名年轻无畏的刺客，在遭逢兄弟会的背叛后转而成为一名「刺客猎杀者」，他将从中体会从刺客转变为圣殿骑士的历程，成就最终目标：摧毁刺客组织。
18世纪，北美，聚焦混乱的法印战争，Shay Patrick Cormac，一位来自刺客兄弟会的无畏战士，历经黑暗的转变，这也将永远改变美殖民地的未来景象，一次危险的任务剑走偏锋后，开始了一场力图消灭所有刺客的旅途，成为历史上最强的刺客猎人。
作为Shay，你将慢慢体会从刺客到刺客猎人的转化，探险之地包括纽约城，河谷，北大西洋的冰川等。
玩法与以往基本相同，加入了冰川探索，可以用其作掩体躲避敌人。
承接前作《刺客信条4：黑旗》，玩家是跨国制药公司Abstergo（现代圣殿骑士团）旗下部门Abstergo Entertainment之员工，被要求进入活跃于1752年七年战争时期之叛变刺客谢伊·帕特里克·寇马可（Shay Patrick Cormac）之记忆。
21岁的谢伊在儿时好友里安·奥布莱恩（Liam O'Brien）介绍下加入刺客组织，在刺客大师阿基里斯·达文波特（Achilles Davenport）等刺客门下接受训练并于一次兼具训练性质的任务中夺得小型风帆战船“摩莉甘”（Morrigan），但其不服从的性格使他与各人相处并不十分融洽。刺客阿特瓦利（Adéwalé）带来消息：太子港在搜索人类以前“第一文明”（First Civilization）密室之行动中因引起地震而被摧毁，谢伊其后被派遣前往调查与该密室相关之一件第一文明遗物和一部手卷。
发明家本杰明·富兰克林（Benjamin Franklin）以电力启动遗物并发现遗物显出全世界各地其他密室之位置，谢伊报告后奉命前往位于里斯本之密室取得室内之第一文明遗物“伊甸碎片”（Piece of Eden），但此时谢伊已因刺客组织拒绝与宿敌圣殿骑士团展开对话，以及命他不久前刺杀一名病危垂死之圣殿骑士而对组织理念产生了疑问。里斯本密室碎片被谢伊接触后粉碎并引发地震，导致城市被毁和大量平民丧生。深感愤怒之谢伊与阿基里斯对质并推断太子港也因相同原因被毁，有感自己所言不获相信和刺客组织为求得伊甸碎片不惜牺牲无辜者，谢伊决定偷取手卷叛离组织但在刺客围捕下中枪受伤坠海。
谢伊被纽约一对平民夫妇救下并获赠一套圣殿骑士袍子，因决心报答该夫妇恩惠而参与打击市内犯罪势力，其行动吸引了一名圣殿骑士上将的注意，表示谢伊能改善众人的生活。在救下另一名圣殿骑士后，谢伊获协助从刺客手上夺回摩莉甘，继以决定为新盟友提供协助。谢伊其后惊悉阿基里斯仍不放弃寻找密室而认为刺客组织对世界构成威胁，遂决定投诚圣殿骑士团成为刺客猎人（Assassin Hunter）对刺客同伴展开复仇，杀害了包括阿特瓦利在内的一众昔日刺客伙伴；谢伊最终接受美洲圣殿骑士团大团长海尔森·肯威（Haytham Kenway）之邀请正式成为圣殿骑士。
在美洲刺客势力只余下阿基里斯和里安两人后，谢伊与海尔森追杀二人至北极圈：另一第一文明密室之所在地。阿基里斯于密室中终明了它们的作用与谢伊所言相同，用以稳定世界而非作为控制世界之武器，但在阻止里安攻击谢伊时导致室内伊甸碎片被毁而引发地震。四人逃走时里安与谢伊进行决斗但伤重战死；阿基里斯被海尔森击败但在即将被杀时因谢伊加以阻止并认为圣殿骑士团应有怜悯之心以免于一死。
1776年12月，谢伊前往法国凡尔赛宫刺杀了查尔斯·多里安（Charles Dorian，详看《刺客信条：大革命》）。记忆录取完毕后，玩家一众上司明确表示他们乃圣殿骑士并著玩家作出选择：加入他们或被枪决。
